靶向PD-1/PD-L1通路的免疫检查点抑制剂的出现，给癌症的临床治疗带来了革命性的变化[1]。不过PD-1抗体的抗癌机制，并不完全为人所知。
其中一个非常关键的问题是，PD-1抗体的抗癌效果，究竟是依赖于在治疗前就存在于肿瘤中的浸润淋巴细胞的再激活？还是PD-1抗体治疗之后，肿瘤外的杀伤T细胞进入肿瘤抗癌？这个问题，目前也是不清楚的[2,3,4]。
如果把这个问题搞清楚的话，医生就可以多一种手段判断患者是不是适合免疫治疗了。
来自斯坦福大学医学院的Howard Y. Chang教授，Anne Lynn S. Chang副教授和Ansuman T. Satpathy助理教授的联合团队想弄明白这个重要的问题。
从左到右依次为：Ansuman T. Satpathy，Anne Lynn S. Chang和Howard Y. Chang（来源：斯坦福大学医学院）
他们从接受PD-1抗体治疗前后的基底细胞癌（BCC）或鳞状细胞癌（SCC）患者身上采集了79046个细胞（包括癌细胞和各种免疫细胞），然后给这些细胞分别做了单细胞RNA测序和T细胞受体测序。
这工作量简直是没谁了，得花多少钱呀
不止奇点糕觉得贵
基于单细胞RNA测序结果，研究人员将所有的细胞分成19个小组，恶性癌细胞两个，T细胞6个，肿瘤基质细胞4个，骨髓细胞3个，B细胞3个和自然杀伤（NK）细胞一个。而且，这个基于RNA测序结果的免疫细胞分类，与之前的研究结果相一致[5]。这也说明，这个测序和分类结果是没有问题的。
快来一起认识下这19个小组
此外，来自不同患者的免疫细胞也都聚集在一起，表明不同患者肿瘤微环境中的免疫细胞类型也基本是一致的。而仔细分析3548个癌细胞的表达谱，很容易发现，不同患者之间肿瘤异质性非常大，这也与之前的研究结果一致[6，7]。
当然了，他们还仔细分析了癌细胞之间的共同标志物，以及表达差异较大的基因，都收获不小。不过，这些都不是本研究的重点。
重点内容是免疫细胞，尤其是浸润性免疫细胞，以及治疗前后的变化，以了解克隆性T细胞对PD-1抗体治疗的反应。
研究人员做的第一件事儿就是把所有的33106个肿瘤浸润性T细胞做了个更细致的分类，包括表达CD4的调节性T细胞（Treg）细胞，滤泡辅助性T（TFH）细胞，T辅助细胞17（TH17）细胞；以及表达CD8的幼稚细胞，记忆T细胞，效应记忆T细胞，活化T细胞，慢性活化/耗竭T细胞（后文统一称为耗竭T细胞），中度耗竭/活化细胞。为了研究清楚，这个分类可真是仔细啊。
再来认识下T细胞的9个分类
初步分析发现，在PD-1抗体治疗之后，滤泡辅助性T细胞，以及活化，耗竭和耗竭/活化的CD8阳性T细胞的频率增加。
而且研究人员还观察到，PD-1抗体治疗之后，增加的耗竭T细胞会表现出慢性激活，T细胞功能障碍和肿瘤反应性的基因特征，与所有其他CD8阳性T细胞相比，耗竭T细胞的克隆水平明显更高。
这些结果与之前的研究基本一致，表明PD-1抗体主要影响CD8阳性T细胞[8，9]。
耗竭性T细胞克隆性增强
那么，对于同一个肿瘤组织而言，治疗前的T细胞类型与治疗后的T细胞类型有没有什么差别呢？
分析结果让研究人员感到意外。
虽然他们观察到记忆T细胞和效应T细胞频繁转换为活化状态，但是治疗前的耗竭T细胞却没有变成治疗后的非耗竭表型。这表明，即使在PD-1抗体治疗后，已经耗竭的肿瘤浸润T细胞也很难变成活化状态了。
真可谓，“一入肿瘤深似海，抗癌从此不可能”。
此外，研究人员还观察到一个有趣的现象，PD-1抗体治疗后才出现的耗竭性T细胞表现出了新的TCR特异性，而且他们也证实，这种治疗前后的抗原特异性差异不是取样时间导致的，而是与PD-1抗体的治疗有关。这也表明，PD-1抗体治疗，可能会促进T细胞具备新的肿瘤抗原特异性。
本研究流程（乱入一张图）
那PD-1抗体处理之后的出现的活化T细胞是哪里的耗竭T细胞转化而来？
外周血是他们想到的第一个来源。
为了分析外周血中是否存在新发现的肿瘤浸润性T细胞，研究人员给5名患者的10份血液样品做了TCR测序，发现35.5%新肿瘤浸润性T细胞可以在PD-1抗体治疗后的外周血中找到，而在治疗前的外周血中只能找到11.8%的新肿瘤浸润性T细胞，不过治疗前的肿瘤里面却没有新肿瘤浸润性T细胞。
外周血中的分布
这个结果也表明，采集外周血监测克隆肿瘤特异性T细胞对PD-1抗体治疗的响应或许是可行的。
研究人员还用26016个鳞状细胞癌患者的肿瘤浸润性T细胞单细胞测序数据，证实了前面的发现。这表明，这种现象可能普遍存在于各种肿瘤中。
总的来说，与“冷”肿瘤相比，“热”肿瘤之所以响应PD-1抗体的治疗，可能是由于“热”肿瘤自身的特质，让它能够不断吸引新T细胞进入[10]，而不是重新激活已有的肿瘤浸润性T细胞。
无论如何，这个研究让我们对免疫检查点抑制剂的作用机制有了新的认知，这对临床治疗和疗效的检测都有一定的价值和意义。如果能找到“热”肿瘤热情好客的原因，或许就能破除“冷”肿瘤的冷。
编辑神叨叨
这个研究绝对还有后续重磅，8万个细胞不是白测的~~
参考资料：
[1].Sharma P, Allison J P. The future of immune checkpoint therapy[J]. Science, , 348(6230): 56-61.
[2].Sakuishi K, Apetoh L, Sullivan J M, et al. Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity[J]. Journal of Experimental Medicine, , 207(10): 2187-2194.
[3].Wherry E J, Kurachi M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion[J]. Nature Reviews Immunology, , 15(8): 486-499.
[4].Pauken K E, Sammons M A, Odorizzi P M, et al. Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade[J]. Science, , 354(6316): 1160-1165.
[5].Calderon D, Nguyen M L T, Mezger A, et al. Landscape of stimulation-responsive chromatin across diverse human immune cells[J]. bioRxiv, : 409722.
[6].Tirosh I, Izar B, Prakadan S M, et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq[J]. Science, , 352(6282): 189-196.
[7].Puram S V, Tirosh I, Parikh A S, et al. Single-cell transcriptomic analysis of primary and metastatic tumor ecosystems in head and neck cancer[J]. Cell, , 171(7): 1611-1624. e24.
[8].Wei S C, Levine J H, Cogdill A P, et al. Distinct cellular mechanisms underlie anti-CTLA-4 and anti-PD-1 checkpoint blockade[J]. Cell, , 170(6): 1120-1133. e17.Wei S C, Levine J H, Cogdill A P, et al. Distinct cellular mechanisms underlie anti-CTLA-4 and anti-PD-1 checkpoint blockade[J]. Cell, , 170(6): 1120-1133. e17.
[9].Sade-Feldman M, Yizhak K, Bjorgaard S L, et al. Defining T cell states associated with response to checkpoint immunotherapy in melanoma[J]. Cell, , 175(4): 998-1013. e20.
[10].Li J, Byrne K T, Yan F, et al. Tumor cell-intrinsic factors underlie heterogeneity of immune cell infiltration and response to immunotherapy[J]. Immunity, , 49(1): 178-193. e7.
本文作者 | BioTalker
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