食管上皮驱动基因突变的发展
癌症由异质性的肿瘤细胞群体构成，这些细胞在基因突变的方面显示了复杂的层级结构。在癌症发展之前，生理正常的组织中可能存在许多独立的癌前克隆，追溯这些癌前病变的克隆特征有助于理解癌症发生及发展的原因。然而，人们对这些克隆从生命早期到寿命结束的长期演化过程知之甚少。微尺度食管样本深度测序表明人类在儿童期就出现多部位的驱动基因突变，随着年龄增长克隆数量和大小增加，并最终覆盖老年人的几乎整个食管上皮。大量吸烟、喝酒等生活方式风险因素会大大加速这一过程。这一研究对我们现存的精准医疗概念提出更多挑战：驱动突变极有可能是机体衰老的自适应反应，并非肿瘤特异性特征；生活方式及环境对于器官组织突变诱导及累积有促进效应，精准医疗需考虑的数据维度可能需要更加宽泛和复杂。
最近，日本京都大学的Akira Yokoyama课题组在Nature上报告了在不同年龄、不同生活方式的人食管中，驱动基因突变的变化情况。
食管鳞状细胞癌（ESCC）是亚洲人群中最常见的食管癌，大量饮酒和吸烟（以下称为“生活方式ESCC风险因素”）在其中的作用早已被证实。具有生活方式ESCC风险因素的个体发生ESCC的风险显着增加，风险比高达6.12，并且经常发展为多种癌症，或在治疗原发肿瘤后发生第二种（异时性）癌症。在这项研究中，研究者从各种年龄和不同生活方式ESCC风险的个体中采集微尺度生理正常的食管上皮样品（PNE），探索食管中的早期突变事件，以及使用全外显子组测序（WES）来研究体细胞突变的无偏检测和拷贝数异常（CNA）。
缩写
ESCC: oesophageal squamous cell carcinoma, 食管鳞状细胞癌
PNE: physiologically normal oesophageal epithelia, 生理正常的食管上皮
CNA: copy-number abnormality, 拷贝数异常
WES: whole-exome sequencing, 全外显子组测序
MCF: mutant-cell fraction, 突变细胞分数
食管样本中的体细胞突变
在图1中，我们可以看到年龄与个体的突变数量呈线性正相关，并且具有大量吸烟、喝酒等高风险生活习惯的患者（红点）突变数量显着增加；样本中突变细胞比例最大值也随着受试者的年龄而增加，但不受生活方式ESCC风险因素的显着影响。这提示我们食管上皮携带的突变累积现象可能是衰老过程中的自适性过程。
图1.PNE, 发育不良和癌症样本中的体细胞突变
研究者通过分析157个PNE，12个发育不良和519个ESCC样品，跟突变的碱基替换特征进而鉴定出了4个突变频谱。
频谱A具有与APOBEC胞苷脱氨酶活性相关的独特突变特征，在ESCC中高度富集。尽管富集程度均不高，相对而言重度烟酒史患者的食管上皮中频谱A富集程度比无ESCC生活风险因素的患者高。
频谱B在癌症患者以及低风险个体中富集程度更高。
频谱C在各样品中无显著变化，起源仍有待阐明。
频谱D主要富集于高风险个体和食管发育不良个体，与饮酒量相关。
PNE中单个细胞的突变
为进一步研究PNE中的突变，研究者对来自3个个体的，源自单PNE细胞的13个克隆进行了全基因组测序，检测到26901个体细胞突变，主要由频谱A-D解释。
来自低风险个体的细胞克隆中的突变数随着年龄的增长而线性增加，平均每个基因组每年增加41.5个突变，或每个外显子组每年增加0.53个突变，这与肠粘膜和肝细胞中报道的比率相当。
图2. 单细胞来源的克隆的全基因组测序
不管生活方式如何，频谱B和C显示了与年龄很好的线性相关性。而频谱D则不一样，高生活风险的个体频谱D远远高于低生活风险的同龄人预测值，这一发现支持了别的论文中频谱D与喝酒相关的观点。
PNE样本中的驱动突变
研究者进一步发现，157个PNE样品与519个ESCC样品中，基因突变频率并不一致，提示PNE和癌症之间的主要驱动因素存在实质性差异。为了进一步研究这一点，使用靶向深度测序技术，在PNE样本的所有24个驱动因子中发现了突变，其分布类似于ESCC中发现的分布。
然而，几种基因的突变频率在PNE和癌症样品之间显着不同，表明在PNE与ESCC中存在离散的阳性选择机制。TP53在大多数癌症（414/519，79.8％）和发育不良（11/12，91.7％）样本发生突变，但在PNE中则少得多（48/157，30.6％）。此外，NNE2L2，CDKN2A和FBXW7在PNE中的突变频率低于癌症样本。相比之下，PNE样本中最频繁突变的基因是NOTCH1和其他NOTCH家族基因（104/157，66.2％），这与癌症样本中不成比例的低频率NOTCH1突变形成鲜明对比（78/519， 15.0％）。
图3. PNE和癌症样品中的驱动突变
对于NOTCH1突变，生活方式风险对突变频率的影响最为显着，其次是PPM1D，EP300，TP53和NOTCH2的突变。
PNE中克隆的结构和历史
为了研究PNE中的克隆结构，我们从16个单活检标本中进行了高密度的0.2平方毫米PNE样本采样（每个样本包含约10000个细胞），随后进行WES或驱动基因的靶向捕获测序。与单独样本的分析相比，对密集采集的微尺度样本的分析使我们能够更精确地解释克隆的空间分布和突变组成。
图4. 高密度采样中克隆的精细结构
在从20多岁的低风险个体中取得的三个样本中，离散的样本集共享具有小MCF的少量突变。每组中的样本携带的非共享突变远多于共享突变，并且在上皮区域中观察到高达18.1 平方毫米被没有共享突变的其他样本在空间上中断。这些研究结果表明，从早期发育到成年早期，快速扩张的食管中的多个干细胞及其后代在邻近区域扩散，相互混合，并且在青春期后局部补充它们所在的食管上皮。因此，在扩散之前获得的少量突变应被视为代表体细镶嵌而不是阳性选择。仅在一小部分具有小MCF的样品中发现了驱动突变，并且很少涉及≥2个样品，这表明有限数量的驱动突变克隆扩大到可检测的大小。
相比之下，老年人中的PNE具有显着不同的克隆结构，例如来自三个高风险（UPN39，UPN134和UPN135）和两个年龄≥70岁的低风险（UPN55和UPN59）个体的五个活组织检查所示，共享突变的数量和MCF显着增加。与镶嵌突变相比，它们更可能被分离成≥2个样本的离散集合，它们紧密地聚集在一起并保持彼此非常接近，占据相对较小的不大于12.8平方毫米的区域。
图5. 驱动基因突变克隆的扩增
在来自所有16个活组织检查的组合结果中，扩增的驱动突变克隆的密度随着年龄而增加，并且暴露于生活方式ESCC风险因素会增强这个趋势。虽然驱动突变克隆在50岁之前仅占所有上皮区域的≤20％，但随着年龄增长，它们的数量和大小增加；在70岁时，它们已经取代了整个食管上皮的大部分。老年人、高风险个体表现出更高的密度突变和一个较大尺寸TP53-突变克隆。携带双等位基因TP53病变的克隆仅在高风险个体的活检中见到。与单采样的观察结果一致，在从老年、高风险个体的活检中观察到较高NOTCH1突变密度，这一现象在双等位基因突变个体中更为显著。PPM1D突变在老年人、高风险人群中也更为常见。
图6. PNE中的克隆进化
对密集采集的微尺度样本中突变的无偏检测也使我们能够说明扩增克隆的进化历史的复杂性，这与PNE的地理亚结构密不可分。在一个从一个81岁的高风险个体中获得的代表性PNE活检标本中，这些不同的克隆位于一个小的上皮区域，起源于一个已经获得NOTCH1突变近80年的单个干细胞。通过大约80年的一系列递归阳性选择，在不同的亚群中以不同的组合固定了4个额外的驱动突变。在另一个实例中，克隆进化由干细胞引发，其中TP53突变发生在约13.2岁之前。在离散的进化分支中获得额外的驱动突变，源自该干细胞的TP53突变细胞群持续存在超过50年而未演变为癌症，并且在70岁的受试者中占据了大约6.6平方毫米的PNE区域。重要的是，高风险和低风险老年人的克隆进化模式存在显着差异：在高风险受试者中，进化树的特征是树高明显更高，树枝更多，树枝总长度更长，驱动突变数量更多。所有这些结合起来，我们可以发现生活方式ESCC风险因素可以显着加速克隆进化。与早期（ 20岁）获得的突变中D突变频谱数量增加，这在低风险个体中未观察到。这表明，在成人生活中，生活方式的ESCC风险因素（最可能是大量饮酒）有助于突变的积累。
小结
驱动基因突变的克隆几乎重塑整个食管上皮
驱动基因突变克隆在婴儿期就多灶性出现，并随年龄增长而增加
不良的生活方式及习惯，如大量抽烟、喝酒，会加速食管上皮重塑过程
参考文献
Yokoyama A, Kakiuchi N, Yoshizato T, et al. Age-related remodelling of oesophageal epithelia by mutated cancer drivers. Nature .
919肿瘤精准免疫公益专项基金是国内第一个以慈善资金的方式进行肿瘤精免治疗和多学科诊疗模式（MDT）诊疗模式的尝试。该专项公益基金构建包括北京协和医院、北大医院、北医三院在内的多家国内知名医院的肿瘤学领域专家组成的MDT专家团队，为晚期肿瘤患者提供免费的专家诊疗服务，同时联合生命科学及医药领域的知名公司，提供免费的前沿的技术支持及药物。欢迎大家关注！
