MAPK通路和老年性聋有关系么

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题目摘要结果参考文献

题目

Deficit of mitogen-activated protein kinase phosphatase 1 (DUSP1) accelerates progressive hearing loss

丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1（DUSP1）的缺乏加速了进行性听力损失

摘要

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）活性受MAPK-磷酸酶1（DUSP1）调节，MAPK/JNK抑制剂的耳保护潜力正在临床试验中进行测试，但是没有研究探讨DUSP1在正常听力维持和听力损失中的作用。在这里，我们显示小鼠耳蜗Dusp1基因具有年龄相关的表达变化。Dusp1基因敲除导致进行性听力丧失过早出现，如Dusp1 -/-小鼠中的听觉诱发反应所证实。其听力损失与毛细胞死亡、螺旋神经元的退化和巨噬细胞浸润的增加相关。机制上，Dusp1 -/-小鼠耳蜗表现出不平衡的氧化还原状态和细胞因子的失调表达。这些数据表明DUSP1对于老化期间耳蜗应激反应及稳态维持至关重要。

缩略词MAPK：丝裂原活化蛋白激酶DUSP1：MAPK-磷酸酶1

结果

结果一主要是研究耳蜗Dusp1表达量随年龄变化（升高），表明Dusp1可能参与耳蜗退化/老年性聋过程，于是结果二构建了Dusp1敲除鼠，发现敲除后会加速老年性聋。注意，老化过程中升高的Dusp1，在敲除后不是保护的，而是破坏性的，跟之前看的某些套路不一样！接下来就是询问耳蜗内哪些结构变化导致了听觉功能差异，结果三显示毛细胞和螺旋神经节在KO鼠中丢失的更多，可能是功能差异的原因。最后测测氧化应激、炎症相关的PCR，染染色，表明听觉功能及组织学表现差异很有可能与这两项生物学活动有关。总的来看，作者做的东西深度没有多深，但是比较稳。

结果一：Dusp1在小鼠内耳中表达的年龄相关性变化在各年龄段小鼠的耳蜗样品中分析Dusp1的表达（图1A）。Dusp1转录本在胚胎日（E）15.5天至1年耳蜗中表达，在耳蜗成熟年龄（2个月）时表达水平增加2倍，在12个月时表达水平是最早胚胎期的4倍。Dusp1在KO小鼠中不表达，但是Dusp2表达显着增加（图1B），这些差异在4-5和8-9个月龄仍然存在。在8-9个月，与野生型小鼠相比，Dusp1缺失小鼠中Dusp5表达也显着降低。这是要说结局的变化也可能是其他Dusp表达变化导致的？此外，我们研究了DUSP1的缺失时，小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞中的应激刺激诱导情况。从野生型和KO小鼠制备E13.5 MEF暴露于UVC光30分钟，如所预期的，由野生型小鼠制备的MEF在应激后显示出DUSP1水平的快速诱导，但是敲除鼠则不然（图1C）。另一方面，在其他MKP的表达中没有差异（图1-补充图1A-C），也没有发现MAPK 11-14的表达谱的年龄演变（图1-图补充图1D）。

图1.小鼠耳蜗中Dusp1和相关磷酸酶的表达。（A）各年龄段小鼠耳蜗Dusp1基因表达。（B）2月龄Dusp1 +/+（浅黄色）和Dusp1 -/-小鼠（深黄色）的耳蜗中诱导型核MKP的耳蜗基因表达。使用Rplp0作为参照基因。（C）使用特异性抗体检测DUSP1表达。UVC光处理或不处理来自Dusp1 +/+或Dusp1 -/-小鼠的MEF细胞，并在刺激后30分钟收获。

结果二：Dusp1的表达对于维持听力是必要的与野生型同窝小鼠相比，KO小鼠从2个月时开始显示ABR阈值升高（图2A），听力阈值的演变随着年龄的增长而恶化，尤其是高频听力（图2B）。我们观察到KO小鼠过早听力丧失从中度（4-5个月）迅速发展到深度（8-9个月以后）并且影响初始高频和低频的听力，在12个月时，表现出全聋，因此在这个年龄之后没有进行进一步的测试。相比之下，野生型小鼠在16-19个月才显示全聋。我们还还在Dusp1杂合小鼠中评估听力，当与野生型小鼠比较时未发现ABR阈值的差异（数据未显示）。我们通过分析ABR波的出现的潜伏期来研究听觉信号的传输速度。2月、4-5月和8-9月龄，KO小鼠显示出I波潜伏期的显着延迟（图2C），8-9个月老鼠还显示出波II和III的延迟，但是没有IV的延迟（数据未显示）。从4-5个月开始KO小鼠显示I-IV和II-IV峰间期显着降低（图2D）。尽管2个月大KO小鼠的峰间期尚未出现差异，但是值得注意的是2月龄KO小鼠就表现出波I延迟以及波I和IV的振幅减小（图2-补充图1）。这些数据一起表明Dusp1 KO小鼠显示出过早和渐进的感觉神经性听力损失。

图2.Dusp1 +/+和Dusp1 -/-小鼠听力评估。（A）各月龄小鼠代表性ABR记录，显示典型I-V波，彩色粗线显示听力阈值。（B）小鼠的ABR阈值。（C）波I延迟。（D）在80dB SPL点击刺激下，峰I-II，II-IV和I-IV间期。

结果三：Dusp1 - / - 小鼠的进行性听力损失与耳蜗细胞改变相关联耳蜗切片的形态学评价表明，2月龄小鼠没有显示出明显的差异，耳蜗的基底和中间转角具有正常细胞结构（图3-补充图2）。5月龄野生型小鼠耳蜗形态保持正常（图3A，a-d），而Dusp1 KO小鼠已经显示Corti器官中毛细胞、支持细胞、神经细胞的丧失（3A，e-h）和螺旋韧带纤维细胞的损失（数据未显示）。耳蜗细胞损失由底圈向顶圈的顺序与上述从高频率到低频率的阈值恶化顺序一致（图2）。8个月大的KO小鼠在耳蜗中间转角处出现Corti器官细胞丢失，而基底转向对神经节细胞的损伤明显，并延伸至中间转弯（图3A，m-p） ）。而8个月大的野生型小鼠仍然保存了保存良好的细胞结构（图3A，i-1）。在耳蜗的顶端转向中未观察到差异（数据未显示）。通过测试特定耳蜗细胞群的分子标记的基因表达进一步证实了细胞损失。因此，Mpz在螺旋神经节和耳蜗神经中表达，作为外周神经系统髓鞘的主要成分（Wang等，）。结合RNA的RbFox3 / NeuN编码核因子在有丝分裂后神经元中表达，并参与神经元功能的发育和维持（Lin等，; Pan等，）。转录因子Sox2是内耳发育所必需的，并且由成体耳蜗中的Schwan细胞和支持细胞表达（Hume等人，; Steevens等人，）。最后，Prestin基因编码在外毛细胞中特异性表达的同源运动蛋白（Zheng等，2000）。图3B显示，Dusp1 KO小鼠中NeuN转录物水平显着降低。Prestin的丢失也很明显。此外，TUNEL测定证实耳蜗细胞丧失是凋亡介导的，图3C显示4-5个月大的KO小鼠的基底和中耳蜗转角中的凋亡神经细胞死亡。在研究的最老年龄12个月，细胞变性进展显示个体差异，表现最差的KO小鼠甚至在顶端转弯中显示外毛细胞损失（研究的3只小鼠中的1只），而野生型动物的顶端转向显示没有改变（研究的2只小鼠中有2只）。5月龄KO鼠已显示毛细胞和神经纤维的广泛变性（图4A），计数证实了KO小鼠基底转角处外毛细胞（OHC）和内毛细胞（IHC）显着减少（图4B）。4-5个月龄DPOAE记录可以进一步证实了KO鼠细胞损失，同时显示阈值增加（图4C和D）。OHC功能失常随着年龄的增长而发展，并且在基因型之间保持显着差异。畸变产物耳声发射（DPOAE）输入-输出（I/O）函数的研究如图4D所示。在研究的最高频率下，4-5个月大的KO小鼠的DPOAE I/O功能显着降低，并且随着小鼠老化，较低频率也出现差异（图4D）。

图3.小鼠的耳蜗细胞结构。（A）Dusp1 +/+和Dusp1 -/-小鼠耳蜗石蜡切片苏木精-伊红染色的代表性显微照片，显示来自耳蜗中间和基底转角的螺旋神经节和Corti器官。插图显示髓鞘蛋白p0免疫组织化学。星号和箭头分别表示没有神经细胞和毛细胞。（B）Dusp1 +/+（浅色条）和Dusp1 -/-小鼠（深色条）中的Mpz，NeuN，Sox2和Prestin的耳蜗基因表达。使用Rplp0作为参考基因。（C）TUNEL细胞凋亡检测，箭头指示阳性细胞。

图4. 小鼠的Corti器。（A）5月龄小鼠的中间和基底转角的Corti器官的代表性共焦图像。星号和箭头分别表示毛细胞和纤维的缺失或存在。（B）中间（距离顶点35-45％）和基底耳蜗转弯的内毛细胞和外毛细胞量化。（C）4-5个月龄和8-9个月年龄小鼠的DPOAE阈值。（D）DPOAE I/O。

结果四：Dusp1缺陷导致耳蜗早期氧化还原失衡为了进一步了解由Dusp1缺乏引起的病理性听力损失表型的分子机制，我们研究了氧化应激和炎症活动，因为这被认为衰老的两个主要标志（Lo"pez-Otı"n等，）。首先通过测量参与氧化还原调节的基因的表达水平来评估氧化状态（图5A）。在分子水平上，2月龄KO小鼠显示，参与谷胱甘肽稳态（Gpx1 [1.8倍]和Gsr [1.5倍]）和谷胱甘肽合成（Gclm [1.5倍]）的酶的转录物的显着增加。然而，在研究的其他年龄中没有发现这些基因表达的诱导（图5A，第一和第二行）。2月龄KO小鼠中线粒体Ucp1减少（1.7倍）和NADPH氧化酶组分（Nox3 [3倍]和Cyba [1.4倍]）表达水平增加。Cyba转录本在基因型之间在5个月时均衡，但在KO小鼠中研究的所有年龄均观察到耳蜗Ucp1和Nox3失调。在Nox4表达水平中未观察到基因型之间的差异（图5A，第三行）。凋亡相关基因Apaf1和Kim1的分析显示Apaf1表达差异，但与2和5个月KO小鼠中Kim1表达增加2.2倍（图5A，第四行） ）。5个月大的KO小鼠显示线粒体抗氧化剂锰超氧化物歧化酶的耳蜗水平降低（MnSOD，1.5倍）。凋亡调节因子BCL-2相关X（BAXb，1.7倍）和磷酸化p38（1.4倍）的β同种型P22phox（1.4倍）水平增加（图5B） ）。在JNK或ERK的活化水平中未观察到显着差异。这些数据表明DUSP1缺乏会在幼鼠体内产生氧化还原失衡，从而逐渐引发炎症和凋亡细胞死亡。为了强化这一假设，我们在2个月大的KO小鼠的螺旋神经节神经细胞中观察到更强的3-硝基酪氨酸（3-NT）免疫反应性，这是自由基对组织蛋白质硝化的结果（图5-补充图1）。为了证实DUSP1的缺失增加了活性氧（ROS）的水平，我们接下来研究了源自小鼠的MEF细胞对氧化剂刺激H2O2的反应。我们的数据显示，H2O2强烈增加Dusp1 KO鼠中的ROS水平（图5-图补充物2A）。这些结果强化了DUSP1调节MEF细胞中氧化应激的理论。为了进一步评估DUSP1缺陷导致DNA损伤并最终导致细胞死亡的可能性，我们接下来定量来自两种基因型的MEF细胞中的g-H2AX相关病灶。结果显示源自Dusp1 KO小鼠的细胞显示出更多的焦点，表明基础条件下的DNA损伤（图5-补充图2B）。

图5.小鼠的耳蜗氧化应激状态。（A）在2,4-8和8-9个月龄小鼠耳蜗中的氧化还原调节和凋亡基因的表达。使用Rplp0作为参照基因。（B）通过蛋白质印迹测量耳蜗蛋白质相对水平。显示了来自5个月大的Dusp1 +/+（浅绿色条）的g-H2AX，P22phox，MnSOD，BAXb，P-p38，P-JNK和P-ERK1 / 2耳蜗蛋白质提取物的代表性印迹和水平的定量。Dusp1 -/-小鼠（深绿色条）。表达水平计算为使用PI3K作为管家蛋白的比率，并归一化至野生型小鼠组。

结果五：Dusp1缺陷引发恶化的炎症反应随后，我们研究了编码促炎和抗炎介质的基因的耳蜗表达（图6A）。我们发现在2月龄KO小鼠中，Il10基因的表达显着增加（Il10,2倍），同时Foxp3的表达降低（1.4倍）。有趣的是，听力损失的进展与炎症失调有关，促炎细胞因子在无效小鼠中被强烈上调。因此，在KO小鼠中，Il1b，Tnfa和Tgfb1表达水平分别增加1.7,1.6和1.6倍。相比之下，在两种基因型中，Il6均未显示出表达差异并且随着衰老而增加。IBA1 +巨噬细胞的浸润是炎症和吞噬耳蜗对损伤的反应的一部分。5和8月龄KO小鼠显示出更多的巨噬细胞浸润（图6B，比较前两列），螺旋韧带中的IBA1 +细胞从基部到顶点的梯度（图6B，图6C中的定量） ）和年龄的进展（图6B，比较中间和右侧列）为了进一步研究DUSP1在炎症中的作用，用TNFα（10ng/ml）处理由野生型和无效小鼠制备的MEF（图6-补充图1）。结果显示TNFα在两种基因型中诱导p38，但是分子凋亡标记物Caspase 3仅在Dusp1 -/- 小鼠中在处理后4小时被切割（激活）（图6-补充图）。

图6.Dusp1 -/-小鼠中恶化的炎症反应。（A）在2,4-8和8-9个月龄小鼠炎性应答基因的耳蜗表达。使用Rplp0作为参照基因。（B）耳蜗冰冻切片IBA1免疫荧光染色，显示顶端，中间和基底转角的螺旋韧带的细节。IV型纤维细胞区域被圈出。箭头指向巨噬细胞。（C）测量IBA1总荧光强度。

结果六：DUSP1缺陷可以增加而MAPK14缺陷可以减少，噪音引起的听力损失暴露于噪音会加速与衰老相关的听力损失。ARHL和噪声诱发的听力损失（NIHL）与ROS产生增加，炎症和OHC凋亡增加有关（Kurabi等，; Wong和Ryan，）。为了测试DUSP1缺陷是否影响噪声诱导的损伤程度，将2个月大的Dusp1 KO和野生型小鼠暴露于噪音中。三天后，Dusp1缺失小鼠严重受损，特别是在8kHz以上的频率中（图7A）。在噪声暴露后14天，16kHz和20kHz的基因型之间的差异持续存在。Dusp1 杂合子显示出与野生型小鼠相似的反应（数据未显示）。为了确认噪声在野生型小鼠中诱导DUSP1，在噪声暴露后45和90分钟采集耳蜗样品，并通过蛋白质印迹测量DUSP1水平。实际上，噪声瞬间诱导DUSP1（噪声后约45分钟）。还对P-p38进行了平行测试，但如上所述，在这些早期的噪声后时间点没有增加（图7B）。因此，为了进一步证实应激激酶的磷酸化水平对于噪声损伤的进展是必不可少的，他莫昔芬（TAM）处理的Mapk14条件性敲入和野生型小鼠也是暴露在噪音中。在TAM处理后这些基因型中没有检测到听阈的差异（图7C，左图，基线）。在Mapk14中具有完全或部分缺陷的小鼠显示ABR阈值变化小于第一次测试的野生型小鼠所显示的那些，表明Mapk14激活在噪声诱导的损伤的进展中起重要作用。

图7. Dusp1和Mkp14缺失小鼠的噪声暴露后的听力损失。（A）噪声暴露后3天和14天ABR阈值。（B）在噪声暴露后45和90分钟，DUSP1和P-p38耳蜗蛋白质提取物的代表性印迹。使用PI3K作为上样对照。（C）Mkp14 +/+和Mpk14 KI/KI小鼠ABR阈值的演变。通过比较基因型的Kruskal-Wallis检验分析统计学显着性差异（* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001）。

严格的说，此处用K-W检验不合适。Kruskal-Wallis检验，即非参数单向anova，用于测量多组间非正态分布数据的差异比较，这里既没有多组（虽然两组也可以），比较也不是身高这样的简单参数（而是听力好坏这样的复合概念，包含多个频率）。其实，像这种两组（KO和不KO）之间某混合指标（听力但是有好几个频率、密度但是包含好几个时间点）的差异检验，我比较赞同这篇文章(Wan, G., and Corfas, G. (). Transient auditory nerve demyelination as a new mechanism for hidden hearing loss. Nat Commun 8, 14487.)上的双因素方差分析 + Bonferroni检验。欢迎后台讨论。

参考文献

Celaya, A.M., Sánchez-Pérez, I., Bermúdez-Muñoz, J.M., Rodríguez-de la Rosa, L., Pintado-Berninches, L., Perona, R., Murillo-Cuesta, S., and Varela-Nieto, I. (). Deficit of mitogen-activated protein kinase phosphatase 1 (DUSP1) accelerates progressive hearing loss. Elife 8.

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