作者|古兴波（1997-），男，研究方向为白酒工艺，酿酒微生物，酒体风味。
白酒是以粮谷为主要原料，以大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏、贮存、勾兑而制成的饮料酒。中国白酒按香型划分为：酱香型、浓香型、清香型等主要香型白酒，此外还有米香型、董香型、兼香型、凤香型、特香型、豉香型、芝麻香型等，以及近年来发展兴起的清酱香型白酒。造成各香型白酒酒体风格差异的原因，除了与糖化发酵剂种类、发酵原料、自然环境和生产工艺等因素有关外，最根本的原因是发酵微生物群落结构的不同，因此，研究白酒酿造体系微生物群落结构，有助于认识白酒发酵过程机理。
起初对酿酒微生物群落结构的研究主要依赖于传统的可培养技术手段。研究表明，自然界中99%以上的微生物不能培养,使得可培养技术得到的研究结果存在一定的局限性。而宏基因组等技术的发展与应用避开了微生物分离纯培养问题,极大拓展了微生物资源的利用空间,增加获得新活性物质的机会和途径。1985年，PACE等首次提出可以通过直接从环境样品中提取微生物的群体基因组DNA，绕过纯培养技术直接对其进行研究，并成功获得了大量前所未知的微生物信息。1998年，Handelsman等提出了宏基因组学(metagenome)概念，并将其定义为：一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法，并第一次使用了Metagenomics这个名词。宏基因组学又称元基因组学、环境(生态)基因组学、群落基因组学，是一种不依赖于人工分离培养的微生物基因组技术。宏基因组技术的发展，为研究白酒酿造微生物多样性提供了新的方法和手段,促进了研究者对于酿酒微生物多样性的认识。本文在介绍宏基因组学技术的基础上，分析其在白酒酿造领域中的研究及应用情况，旨在为认识白酒的发酵机理提供理论指导。
宏基因组学研究策略
宏基因组学研究的基本策略流程为：样品和基因(组)的富集；提取特定环境中的基因组DNA或者RNA；构建宏基因组文库以筛选目的基因；目的基因活性产物表达。
1.1环境样品及目的基因组富集
对环境样品的预富集可以提高目的基因的检出几率。目前，预富集技术主要分为细胞水平富集和基因组水平富集。其中，细胞水平富集主要是通过利用选择培养基对目标微生物进行富集培养，最常用的方法是底物选择，此外还包括营养选择及物理化学指标选择。但是由于富集培养选择性地富集了具有快速生长特性的菌群，因此导致大部分物种多样性信息丢失。目前可以通过先在严格胁迫条件下短期处理，然后改为较温和的处理条件，可以在一定程度上克服这种方法的局限性。基因组水平富集常用的技术为稳定同位素探针技术(SIP），此外，还有抑制性消减杂交技术、差异显示技术、噬菌体展示技术、亲和捕获技术及DNA微阵技术等。
1.2宏基因组DNA或者RNA的提取
DNA或者RNA的提取是宏基因组学用于微生物群落结构研究的基础，DNA或RNA提取的质量决定了后续分析的质量。对于不同类型的样品采用不同的DNA或者RNA提取策略。Luna等在对海洋沉积样品采用不同的DNA提取策略来研究不同的实验方法对深海微生物多样性是否有影响，结果证明只采用单一的DNA提取方法会极大地低估微生物多样性。此外，对一些特殊的如烃和重金属含量较高的土壤或者沉积样品采用表面活性剂或者鳌合剂进行润洗可以增加DNA的得率。
宏基因组DNA或者RNA的提取方法可分为直接提取法和间接提取法。直接提取法不需要将细胞从样品中提取出来，所提取的DNA似乎更能代表样品的微生物群落，缺点是提取DNA的同时也提取了样品中的其他成分，有些成分会干扰后续实验。间接提取法是在裂解释放DNA之前，先将微生物细胞从它们的环境基质中分离出来，这一方法的局限主要是很多细菌会吸附在样品颗粒上不能被分离出来，结果将会导致所反映结果中微生物群落具有片面性。因此，为了确定不同的微生物群落成员在其中可能起到的作用，所选择的DNA提取方法除了要考虑样品类型外，还要能够将游离于细胞外的DNA以及己经死亡的细胞的DNA与具有活性的细胞的DNA区分开来。Nocker和Campe通过添加EMA来去除环境样品群落中的死亡细胞中的DNA。
1.3宏基因组文库的构建
1.3.1载体的选择
载体选择的原则主要考虑是否有利于目标基因的扩增和表达，以及在筛选细胞毒类物质时表达量的调控等。根据克隆载体的不同，宏基因组文库可分为质粒文库、细菌/酵母人工染色体文库、噬菌体类载体文库。早期宏基因组文库主要以质粒载体和大肠杆菌宿主细胞构建而成的小片段(＜15kb)文库。该文库操作简便、拷贝数高、对DNA质量要求不高，适合纯度低或剪切较严重的DNA模版。但插入片段小，筛选量大，活性比率低，主要适用于分析新的基因序列信息及筛选编码代谢相关的单一基因或小操纵子。Fosmid文库和Cosmid文库能容纳15～40kb的外源DNA，同时己经成功构建了容量高达200～350kb外源DNA的细菌人工染色体文库和酵母人工染色体文库。该文库不仅拥有巨大的插入片段载量，而且稳定性好、筛选效率高、克隆表达能力强，可获得基因簇表达活性物质。主要用于分析某一生境中微生物群落多样性及筛选由基因簇或多个基因控制表达的活性物质。但其操作较复杂繁琐、对DNA纯度要求较高，且拷贝数低，扩增较困难。此外，λ-噬菌体和其他病毒也可以作为构建宏基因组克隆文库的载体。
1.3.2宿主细胞的选择
宿主菌株的选择主要考虑转化效率、重组载体在宿主细胞中的稳定性、宏基因的表达、目标性状(如抗菌)缺陷型等因素。E.coli操作简单、繁殖迅速、培养代谢易于控制，是最常用的宿主细胞。但是由于环境样品的总DNA有很大一部分为真核基因组DNA，其在细菌宿主中往往不能表达，大大限制了这部分基因的筛选。也有报道利用链霉菌、假单胞菌等真菌作为受体来鉴定有关新抗生素生物合成的基因，但技术还不成熟。
1.4宏基因组文库筛选
1.4.1序列依赖性筛选法
序列依赖性筛选法是根据文库中的己知序列或保守序列来设计杂交探针或PCR引物，从宏基因组文库中筛选目标序列。功能基因PCR扩增技术是最为常用的序列依赖性筛选法。此外，还有微序列技术(Microarray，又称基因芯片)和焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术等。序列分析法需要根据已知的基因和基因表达产物的保守序列设计引物和探针，因此，对鉴定新的基因成员有一定的局限性，且PCR往往只能获得部分基因的扩增。，刘小乐等开发出一种统计方法，被称为基于模型的全基因组CRISPR/Cas9敲除分析（MAGeCK），来确定来自于CRISPR/Cas9筛选的必需sgRNA、基因和通路。Margulies等描述了一个可扩展，高度并行的测序系统microfabricatedhigh-densitypicolitrereactors，原始吞吐量显着大于最先进的毛细管电泳仪器。能够在4h运行中以99%或更好的精确度测序2500万个碱基，并开发了用于DNA扩增的乳液方法和用于使用针对固体支持物和皮升级体积优化的焦磷酸测序方案的通过合成测序的仪器。通过鸟枪测序和从头组装的支原体生殖基因组展示这个系统的效用，吞(原载于中国白酒杂志第20期)吐量、准确性和鲁棒性，96%的覆盖率在99.96%的精度在一台机器的运行。由CRISPR/Cas9技术与单指导RNA（sgRNA）库介导的阵列遗传筛选需要高通量平台，能够在全基因组规模高效率地转染不同的细胞类型，用于检测和分析复杂的细胞表型。Bian等开发了高通量原位细胞电穿孔（HiCEP）微系统。成功地将编码增强的绿色和红色荧光蛋白（EGFP和ERFP）的两种质粒在169微孔阵列芯片上电穿孔连接到附着的HeLa细胞中，转染效率为71.6%±11.4%和62.9%±2.7%，细胞存活率高于95%。并成功地将sgRNA选择性电穿孔到以高通量方式表达Cas9核酸酶的293T细胞中，观察到由于修复由CRISPR/Cas9系统介导的蛋白质编码序列而导致的GFP强度增加4倍。这项研究证明，这种HiCEP系统在将来用于难转染细胞上的全基因组CRISPR文库的阵列功能筛选中具有巨大的潜力。
1.4.2非序列依赖性筛选法
非序列依赖性筛选法，其不依赖于任何己知序列信息，仅根据文库克隆子产生的活性物质进行筛选。其中，以功能筛选法最为常用，此外还有底物诱导基因表达(SIGEX)法、稳定性同位素技术筛选法、荧光原位杂交技术筛选法、基因陷阱技术等。
1.5宏基因组数据分析
目前，针对微生物群落高通量测序数据分析的软件主要有Mothur、MEGAN、Qiime、JCoast以及STAMP。，李昂开发了基于Linux平台的宏基因组分析软件MINT。,李俊锋开发了一套完整的16SrRNA基因测序数据处理流程关于宏基因组测序数据，为仅考虑物种分类和丰度信息的情况建立了一套高效率、高一致性的数据处理流程。，美国LosAlamos国家实验室的科学家们向人们展示了一套宏基因组分析的新工具-GOTTCHA(GenomicOriginsThroughTaxonomicCHAllenge)。这一工具能在核酸数据中寻找符合要求的独特序列，可以对鸟枪法宏基因组学数据进行非常精确的分类，在复杂样本中进行物种鉴定和相对丰度分析，能够同时鉴定细菌和病毒序列。GOTTCHA也被成功用于难以处理的环境和临床样本，表现出超越其他现有方法的卓越性能。，有研究者在GenomeBiology杂志上发表文章，概述了RNA-seq生物信息学分析的现行标准和现有资源，为人们提供了一份带有注释的RNAseq数据分析指南。这份指南覆盖了RNA-seq数据分析的所有主要步骤，比如质量控制、读段比对、基因和转录本定量、差异性基因表达、功能分析、基因融合检测、eQTL图谱分析等等。此外，他们还介绍了RNA-seq数据与其他数据类型的整合。这种数据整合可以将基因表达调控与分子生理学和功能基因组学关联起来，如今越来越受到研究者的欢迎。
宏基因组学在白酒行业中的研究现状及应用
2.1宏基因组学技术应用于发掘白酒微生物资源
2.1.1宏基因组技术克隆分离功能基因
从环境中提取高质量DNA，构建宏基因组文库，从中筛选到功能基因或基因簇，展示宏基因组技术从环境中克隆任何生物体基因的可能性。通过构建宏基因组文库，从中鉴定出的大多数基因都是新的基因。宏基因组技术可以应用于微生物基因资源的“生物探矿”。利用宏基因组文库，已发现的新基因主要有：生物催化剂基因、抗生素抗性基因以及编码转运蛋白基因等。如纤维素酶基因、分解脂肪的基因、分解淀粉的基因、甲烷单加氧酶基因、红曲霉功能基因等。
2.1.2宏基因组技术筛选有价值的功能酶
近年来，宏基因组学技术对生物催化剂——新酶的筛选发现层出不穷。与大曲酒生产有关的酶类如淀粉酶、蛋白酶、氧化还原酶、脂肪酶、酯酶等新功能酶（详见表1），并可能获得新酶的特征信息。特别是对于未培养微生物产生的酶类，通过宏基因组技术从环境中筛选分离得出，加以研究应用。大曲酒的固态发酵酒醅中含有多种微生物产生的多酶体系，一方面将原料中蛋白质、糖类、脂肪等大分子物质逐渐分解，供自身代谢作用；另一方面为乙醇和香味组分提供前体物质，或参与重要香味组分物质的形成。但是，目前对大曲酒发酵的功能酶和酶系的深入研究还是太少。因此，借助宏基因组技术分离纯化大曲酒微生物分泌的功能酶，发现大曲酒生产用微生物的新的功能酶类，以利用这些酶类在大曲酒酿造过程发挥应有的作用。
表1已构建的宏基因组文库及其筛选到的活性克隆
2.1.3宏基因组技术选育微生物功能菌
生丝微菌是一类以甲醇作为唯一碳源和能源，通过出芽过程繁殖的柄细菌。该菌的生理特性使其难分离培养。吴衍庸等从酒窖环境中分离出生丝微菌(Hyphomacrobaum)的1株纯培养菌株，由于该菌具有生长消耗甲醇的生理特征，在老窖中的发现和分离，有可能对老窖发酵生产出的大曲酒所含的甲醇进行有效的调控。宏基因组技术不必经过纯培养的分离方法，也可以寻找甲醇生物降解的功能菌。Radajewski等利用13C标记甲醇投加到橡树林的土壤，富集一段时间，提取土壤总DNA，建立宏基因组文库，筛选出13C标记的DNA，经16SrRNA扩增后，鉴定出一些微生物是可以利用甲醇做为碳源的微生物种群。
从大曲微生物、窖泥微生物以及生产现场环境微生物构成糟醅酿造微生物区系，通过发酵产品体现窖池主要功能菌的存在状态。通过分离宏基因组文库的基因，根据该基因寻找相应的微生物功能菌，可以达到认识功能菌效用和发挥其作用的目的。宏基因组学技术根据编码基因寻找新微生物的培养条件，为微生物纯培养技术提供可供选择的培养基资源。如用4-羟基丁酸作唯一的碳源和能源筛选到了5个能够稳定利用4-羟基丁酸的(原载于中国白酒杂志第20期)克隆子。经分析，这些克隆子具有4-羟基丁酸脱氢酶活性，据此可以利用该基因编码的活性物质4-羟基丁酸作唯一的碳源，开展实验室纯培养。该方法主要是基于活性筛选技术的特殊条件——选择性培养基，可以打破宏基因组技术对微生物功能菌的“可知不可求”的局面，它为实验室培养编码新基因的微生物提供了一条新途径。所以，大曲酒的未培养微生物功能菌的获得，可以借助根据宏基因组文库提供的线索，通过新的培养方法，获得具有重要生态功能的新的功能菌或未培养微生物的功能菌。
2.2宏基因组学技术应用于白酒微生物多样性研究
2.2.1宏基因组学技术应用于浓香型白酒微生物多样性研究
（1）窖泥微生物的研究
中国浓香型白酒在工艺上与其他三大香型白酒最大的区别在于采用泥窖发酵，窖泥对于浓香型白酒“窖香浓郁，绵甜醇厚”风格的形成具有不可替代的作用。探索中国浓香型白酒窖池窖泥中微生物群落构成及其系统发育对浓香型白酒生产及品质监控具有重要的指导意义。
董雅舒应用PCR-DGGE技术对浓香型白酒窖池细菌菌群进行了分析，测定了5种样品中的细菌菌群的组成，并构建了系统发育树，得出浓香型窖池微生物具有明显的多样性。王福祯通过454焦磷酸测序法，对8个浓香型窖泥样本中原核和真核微生物进行了分析，发现原核微生物分属于18个门，213个属，细菌总OTUs有1183个。同时还发现真核微生物群落分属于5个门，9个纲，10个目，13个科，18个属，真菌总OTU种类为64个。王莉等以细菌16SrDNA的V6区为对象，采用Illamina高通量测序平台进行深度测序技术，对比分析了酱香型窖底泥与土壤微生物的差异。共获得14156条高质量的V6区标签序，聚类分析共产生1801条OTU序列，其中土壤样本680条，使用1个月的窖底泥样本629条，使用12个月的窖底泥样本492条。向文良等人利用PBS缓冲液富集窖池酒醅中的微生物菌体，研究窖池中微生物区系分布及相互关系。在分子分类水平上，运用PCR扩增技术和16SrDNA序列同源性分析等方法测定窖池中原核微生物的16SrRNA基因全序列，根据与基因数据库中相似菌群16SrDNA序列的同源性比较建立系统发育树图。
Ding等通过nestedPCR-DGGE研究中国浓香型白酒的窖泥中的真菌和古菌群落多样性，比较了取自窖池四壁（CW）和窖池底部（Cb）的窖泥真细菌和古细菌的微生物群落结构。此外，邓杰、黄治国等研究了窖池古菌群落结构及系统发育学分析，以及不同窖龄窖池窖泥中古菌群落结构；何翠容等研究了浓香型白酒窖池细菌与古菌随窖龄变化的特征；罗杰等研究了浓香型白酒窖池窖泥中原核微生物菌群；于春涛等分析了不同产区浓香型白酒窖泥中细菌多样性和窖泥变质前后古菌群落差异；施思研究了不同窖泥的微生物群落特征；汤斌研究了窖泥中细菌多样性的免培养技术；王涛等研究了宜宾浓香型白酒窖泥中细菌的系统发育多样性；刘茂柯等研究了窖泥古菌群落结构及其多样性；陈卫东从微观角度论述了窖泥微生境的形成，阐述了环境因子、微生境分化及界面微生物细胞间的关系。唐玉明等对沪州老窖老窖池窖泥特性进行了系统分析，剖析了窖泥中各种理化成分的组成及新、老窖泥的特性差异。张丽莺从环境因子、微生物区系及香气成分三方面探讨了窖池微生态在发酵过程中的变化情况，并据此建立了窖池微生态信息管理库软件。罗海、刘森等人对窖池不同空间位置窖泥所处的环境因子进行监测，分析了窖池发酵过程中不同空间位置和不同发酵时间糟醅的环境因子伴随微生物活动而发生的动态变化规律。
（2）酒曲微生物的研究
传统固态发酵白酒酒曲采用开放式生产，白酒微生物种类繁多，群系复杂，采用传统的分离培养方法研究，会遗漏很多微生物种类，甚至可能是关键性功能微生物。随着现代生物学技术的迅速发展，应用分子生物学技术对酒曲的研究也越来越多。
叶光斌应用PCR-DGGE技术解析浓香型大曲发酵储藏过程以及真菌群落的演替规律，结果表明，大曲真菌微生物复杂多样，发酵环境以及真菌间的协调作用都对真菌的群落组成产生影响。王世宽对PCR-DGGE用于浓香型大曲微生物群落分析的条件进行了优化，结果表明，细菌DGGE电泳最佳变性剂浓度梯度为35%～55%，真菌的最佳浓度为30%～50%，运用优化后的条件进行测定，得出较丰富的微生物群落。李家民用DGGE方法初步分析了浓香型大曲微生物真菌群落结构，结果表明，曲内微生物群落结构因大曲部位的不同而有所差异。PCR-SSCP(单链构象多态性)技术是通过DNA构象差别来检测点突变的方法。长度相同碱基序列不同的单链DNA构象不同，形成了单链构象多态性，因而也适合分析微生物的多样性，如罗惠波用该法解析了浓香型大曲原核、真核微生物群落，结果表明，发酵各时期曲样的群落结构相似，同时也具有多态性；不同微生物群落具有协同和制约的复杂生态学效应；各时期曲样微生物多样性指数均在1.69～2.01之间，群落结构相对较稳定；各曲样微生物群落相似性位于0.67～1.00之间，邻(原载于中国白酒杂志第20期)近时期样品间的相似性程度较高；主要优势真菌的菌群变化及生物学特征说明其代谢活动与浓香型白酒糟醅发酵中大分子物质的降解及白酒风味物质的形成密切相关。李家民等用DGGE分析浓香型大曲时发现电泳图中大曲真菌的条带可多达21种，进一步对优势菌条带鉴定为根霉(Rhizopus sp.SAUFS3-1)、有孢圆酵母(Torulaspora sp.SG5S08)和丝衣霉状篮状菌(Talaromycesyssochlamydoides)。叶光斌等用PCR-DGGE条带多样品性及变化规律分析发现浓香型大曲发酵、储藏过程中真菌多样性演替规律。刘孟华以剑南春酒曲为研究对象，采用宏基因组学方法提取总基因组DNA，经PCR扩增16SrDNAV4区构建文库并测序，进行剑南春酒曲中细菌群落多样性的研究。结果表明，剑南春酒曲微生物群落构成较稳定，主要分布在Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria三大门中，占总量的95%以上。
（3）酒醅微生物的研究
Sun等通过IlluminaMiseq测序分析不同季节的中国浓香型白酒生产中的细菌多样性，揭示了先前在糟醅中未鉴定的放线菌纲、普雷沃氏菌属、产碱杆菌属和葡萄糖醋杆菌。且结果证实，酿造季节对细菌群落结构的形成有关键影响。不同的酿造季节对发酵温度和环境水分起到决定性作用，影响微生物的生长和死亡，改变细菌群落的数量，并在糟醅中形成独特的细菌组成。向文良等利用16SRNA分析手段，对窖池糟醅中的微生物群落的区系分析及相互关系进行研究。张文学、乔宗伟等对浓香型白酒窖池酒醅中细菌菌群、真菌菌群、微生物区系进行了动态分析。冯治平采用PCRSSCP技术研究了浓香型白酒酒醅发酵过程中古菌群落的变化规律，结果发现古菌群落在发酵过程中的变化较小。
2.2.2宏基因组学技术应用于酱香型白酒微生物多样性研究
谭映月等应用PCR-DGGE技术分析酱香型白酒酒曲微生物多样性，得出酱香型白酒微生物群落组成存在明显差异。袁帅以茅台、国台第4次蒸馏前的酒糟为研究对象，对酱香型酒糟中细菌多样性进行研究，构建16SrDNAV4区文库进行高通量测序分析，分别读出6755和6738个OTUs,主要分属11个门。
2.2.3宏基因组学技术应用于清香型白酒微生物多样性研究
兰玉倩等应用PCR-DGGE指纹技术分析了清香大曲酵母群落结构，得出在大曲生产过程中有7种主要的真菌。王海燕应用PCR-DGGE技术对清香型汾酒微生物群落结构演替进行了研究。Zheng等通过可培养和未培养方法研究了汾酒大曲中的微生物多样性。基于其16SrDNA（细菌）、26SrDNA和ITS区（真菌）的序列，分离并鉴定了总共190个微生物菌株，包括109个细菌和81个酵母菌和霉菌。乔晓梅等利用高通量测序法分析了冷季和热季清香型白酒生产用曲真菌群落结构，结果共比对出90种真核生物。
2.2.4宏基因组学技术应用于其他香型白酒微生物多样性研究
李德林等用PCR-DGGE技术对白酒酒醅微生物群落结构进行解析。结果表明，酒醅中微生物有18个属。高亦豹等利用PCR-DGGE未培养技术，对中国白酒5种高温大曲和中温大曲细菌群落结构分析，鉴定了大曲中细菌菌落信息。司波等对PCR-DGGE技术在微生物群落研究方面的优缺点进行了分析，并着重就其应用进行了阐述。孟镇等用PCR-DGGE电泳条带分析中国白酒大曲中细菌多样性，并没有鉴定出微生物的具体组成。罗惠波等和高亦豹等人利用PCR-DGGE技术分析中高温大曲细菌群落结构。乔宗伟等以常规的菌落分离培养及分类鉴定方法为主，以16SrDNA、18SrDNA序列分析为补充对全兴酒厂酒醅微生物区系进行了分析。张晶运用PCR-DGGE技术研究了稻花香大曲微生物的群落结构和动态变化规律。卫春会研究了窖泥微生物群落SSCP分析条件优化。
2.3宏基因组技术应用于白酒香味组分物质的研究
中国传统大曲酒是世界上香味成分最为丰富的蒸馏酒。包括乙醇、高级醇、有机酸、酯、内酯、羰基化合物、芳香化合物、含氮化合物、含硫化合物等。据研究，茅台酒有936个色谱峰，浓香型酒有674个色谱峰，清香型酒有486个色谱峰。这些复杂的香味物质来自大曲酒的生产原料、特殊的酿造工艺及众多微生物的发酵代谢产生。宏基因组技术为揭示大曲酒的酒香奥秘开辟出新天地。通过宏基因组筛选可以得到微生物代谢合成的有价值的化合物。新的化合物的筛选在一定条件下，先测定不同结构的物质在色谱中呈现不同的峰值，与宏基因组的基因片段转入和未转入外源基因的宿主细胞或发酵液抽提物的色谱图参照，来筛选产生新的化合物克隆子。如Courtois等构建了土壤穿梭粘粒载体文库，筛选出5000个克隆，从中发现了11个新的聚酮合酶1(PKSI)的基因，采用HPLC技术发现了脂肪二烯醇中2种互为同分异构体的新化合物。Wang等在筛选以链霉菌为宿主构建的宏基因组文库中，从1020个克隆子中发现2个产生新结构化合物的克隆子，进一步纯化分析获得了A-E5种新的小分子抗菌化合物。
因此，运用宏基因组技术构建大曲酒微生物的宏基因文库，通过特定筛选方法发现新的化合物来揭示大曲酒的香味物质的未知组分。崔利等对酱香型大曲酒含有众多的香味物质吡嗪化合物提出一个推断：在高温制曲、高温堆积环节、高温发酵过程所产生的吡嗪化合物，除了酶和非酶参与的褐变反应外，应该说有相当部分是微生物代谢产物，因为这3个阶段中都有能够产生吡嗪化合物的大量枯草杆菌。对此推断，可以通过宏基因组技术通过试验加以验证。在高温制曲、高温堆积环节、高温发酵3阶段，宏基因组技术提取环境微生物DNA，构建宏基因组文库，通过测定吡嗪化合物的色谱峰，参照宏基因组的基因片段转入和未转入外源基因的宿主细胞或发酵液抽提物的色谱图，来筛选能够产生吡嗪化合物的克隆子，通过基因测序分析和16SrRNA扩增鉴定，有可能找出产生吡嗪化合物的那一种微生物。Wang等进行基于PCR的变性梯度凝胶电泳（DGGE）和16SrRNA基因文库分析，分析两种不同原料发酵的中国酒的细菌群落结构。结果表明，强香味发酵谷物中的主要细菌是来自类芽孢杆菌，拟杆菌属和梭菌的主要细菌，而焙烤芝麻香味发酵谷物中的主要细菌属于芽孢杆菌，黄杆菌和丙酮杆菌。液体发酵的细菌多样性的分子分析将有益于在液体香料成分的形成中起关键作用的重要微生物的分析。Li等使用克隆库和焦磷酸测序法研究了清香型酒汾酒的细菌和真菌群落多样性。通常，只有几种类型的细菌和真菌是有助于白酒发酵过程的主要微生物。我们的研究结果表明，更多不同的细菌和真菌物种联合的作用贡献了汾酒在不同时期的发酵过程。这项研究提供的证据表明，添加一种或多种细菌和真菌物种可以改善传统或工业酵母菌株发酵中酒的质量。此外，在不同时间段有助于发酵过程的细菌和真菌物种的知识可能有助于控制酒的生产系统和提高酒的质量。另一方面，潜在地篡改汾酒质量的细菌和真菌物种应该受到更多的关注和进一步的研究。关于对化学和物理性质与主要微生物之间的相关性，以及有助于发酵过程细菌和真菌的假设类型，进行更详细检验的进一步研究是必要的。
结 论
宏基因组学在白酒行业中的研究主要集中在微生物多样性研究方面，其中关于浓香型白酒的研究很多，酱香型、清香型和其他香型白酒的研究相对少一点。此外，宏基因组学在白酒微生物资源发掘和白酒香味组分的研究方面，也起了很大的推动作用。对白酒酿造微生物的研究，多年来一直是行业热点，但对微生物群落作为整体的性能认识是不足或片面的，特别是微生物菌群和多酶体系的认识缺乏，影响我们对白酒微生物菌落代谢机理的系统全面的认识。另外，缺乏系统性的研究。比如酱香型白酒1轮次到7轮次的微生物区系，发酵过程中微生物组成变化、功能微生物组成及变化、功能性成分分析、风味组分研究、微生物菌落代谢机理等等，缺乏系统性的研究。不同香型，不同地区白酒之间的这些研究也缺乏系统的横向比较。人类基因组测序完成已有许多年。但是，基因组信息如何指导基因在特定空间和时间表达的机理仍有待阐明。这些问题并不能只依赖宏基因组学解决，基于此，我们可以采用宏基因组学、宏蛋白组学，宏代谢组学，宏转录组学、风味组学等方法，并结合全基因组的三维空间结构和功能研究，更加系统深入的研究认识白酒酿造过程和组成成分。（完）
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